noemt men tegenwoordig in den regel, in navolging van Waksman, de van micro-organismen afkomstige stoffen, die in staat zijn de ontwikkeling van andere micro-organismen te remmen. Er zijn schimmels, die tijdens de groei stoffen maken, die zich in de omgeving van de schimmelkolonie verspreiden en door haar giftige eigenschappen de groei van andere schimmels of bacteriën onmogelijk maken.
In zulk een geval spreekt men wel van antagonisme. De term antibiotica is afkomstig van antibiosis. Dit begrip, ruim opgevat, geldt dus evenzeer voor de leeuw, die zijn prooi verslindt, als voor het schimmelantagonisme.Geschiedenis.
Het onderzoek over antibiotica dateert van ongeveer 70 jaar geleden. Pasteur en zijn medewerkers hebben reeds in 1877 waarnemingen over antibiose gedaan, waarbij ziekteverwekkende micro-organismen waren betrokken. Het bleek hun dat miltvuurbacteriën in steriele urine, hetzij neutraal dan wel zwak alkalisch, uitstekend gedijden, terwijl zij zich niet meer vermenigvuldigden, zodra deze urine met een of andere „gewone” bacterie secundair werd geïnfecteerd. Bovendien stelden zij vast, dat daarvoor gevoelige dieren na inspuiting met een suspensie van miltvuurbacteriën snel stierven, maar in leven bleven wanneer deze suspensie eveneens de eerder genoemde „gewone” bacteriën bevatte. Op grond hiervan opperden zij reeds de mogelijkheid, deze antibiose voor de therapie te gebruiken.
Met deze bevindingen van Pasteur c.s. begon een periode van onderzoek, waaruit hierna slechts de meest markante onderzoekingen kunnen worden vastgelegd. Daarbij verdienen in het bijzonder die nasporingen de aandacht, die hetzij methodisch, hetzij door de probleemstelling, in zekere zin een equivalent vormen van de onderzoekingen uit onze dagen, die tot het isoleren van penicilline hebben gevoerd. Methodisch dan ligt een begin bij Garré, die in 1877 in streepcultures van verschillende micro-organismen naast elkaar de wederzijdse beïnvloeding bestudeerde en uitgesproken antagonismen waarnam. In een publicatie van Frost uit 1904 is deze werkwijze in een duidelijke afbeelding voor het antagonisme tussen Pseudomonas fluorescens en Bact. typhosum weergegeven. De waarneming van Lode in 1903, dat rondom een toevallige luchtinfectie op een plaat van Microc. tetragenus de oorspronkelijke cultuur verdween is wel een volkomen parallel van Fleming’s nader te bespreken vondst, die tot penicilline voerde. De antagonist bleek een Grampositieve coccus (z bacteriologie) te zijn en werd met Microc. antagonismus aangeduid.
Lode toonde tevens aan, dat dit micro-organisme een stof produceerde die de groei van Microc. tetragenus remde en eenzelfde effect had op cultures van B. anthracis en Staphylococcus aureus, maar niet op die van B. coli. Reeds vroeg heeft men getracht de actieve stoffen in extract of min of meer gezuiverde vorm af te zonderen en zo mogelijk voor therapeutische doeleinden te gebruiken. In 1896 isoleerde Gosio uit een Penicillium een stof in zuivere toestand, welke de groei van B. anthracis belemmerde en mycophenolzuur werd genoemd.
Deze stof kan als het eerste kristallijn verkregen antibioticum worden beschouwd. In 1946 isoleerden Florey en medewerkers deze stof overigens opnieuw, nu uit Penicillium brevicompactum Dierckx. Zij bleek mede interessant te zijn door een vrij sterke werking tegen een aantal voor mens en plant ziekteverwekkende schimmels. Emmerich en Löw introduceerden in 1899 als eersten een antibacterieel extract uit oude cultures van Ps. pyocyanea voor medische toepassing, pyocyanase genaamd, dat in vitro (d.i. bij proeven buiten het levende organisme, dus in reageerbuizen of op kunstmatige voedingsbodems) de verwekkers van miltvuur, typhus en diphtherie oploste. Klinisch werden met pyocyanase practisch alle proefnemingen verricht, welke later bij penicilline zouden worden herhaald. Na 1900 handhaafde het extract zich nog een tijd voor locale toepassing. Ten slotte verdienen nog vermelding de onderzoekers: Nicolle (1907), Rappin (1912) en Vaudremer (1913), die uit cultures van verschillende micro-organismen (B. subtilis, B. mesentericus, B. megatherium, Aspergillus fumigatus) extracten verkregen, welke „in vitro” actief tegen Myc. tuberculosis waren.
In 1928 deed Fleming zijn nu zo beroemde waarneming. Hij zag, dat rondom een verontreiniging met schimmels van een met Staphylococcus aureus geënte kweekplaat, de cultuur dezer Staphylococcen oploste. Uit de hierboven geschetste voorgeschiedenis blijkt afdoende, dat in deze waarneming van Fleming geen principieel novum werd gezien. De grote verdienste van Fleming was echter, dat hij naar deze verschijnselen keek, en de mogelijke betekenis inziende, niet als gebruikelijk besloot, om de verontreinigde plaat zo snel mogelijk te vernietigen. Zijn vroegere studies over de afweer van het menselijke lichaam tegen binnendringende pathogene kiemen, in het bijzonder die over lysozyme (een vooral in het traanvocht voorkomende stof, welke het oog in sterke mate voor infectie behoedt), verklaren deze beslissing. Fleming was in menig opzicht „de voorbereide mens”, wien, volgens Pasteur, het geluk dient.
De infectie op de staphylococcus-cultuur bleek een schimmel te zijn van de Penicillium groep en werd nader als Penicillium notatum Westling gedetermineerd.
Penicilline
Deze stam bleek in zijn cultuurvloeistof een stof te produceren, welke in dit milieu een sterk remmende werking op de groei van verschillende micro-organismen, gelijk staphylococcen, pneumococcen en streptococcen, uitoefende. B. coli en B. influenza bleken daarentegen niet te worden beïnvloed. Oorspronkelijk werd de benaming penicilline door Fleming gebezigd voor het filtraat van de cultuurvloeistof later ging zij over op de actieve stof. Fleming stelde de geringe giftigheid der penicilline bevattende cultuurvloeistof vast en wees op mogelijke therapeutische betekenis voor wondbehandeling. Chemisch werd het probleem echter niet verder uitgewerkt, zodat enkele klinische proeven slechts met ruwe filtraten van cultures werden uitgevoerd. Het effect was niet groot en de studie werd in deze richting niet voortgezet. Wel werd het ruwe penicilline in de bacteriologische methodiek toegepast, bijv. ter verkrijging van rein-cultures van de B. influenza en van de verwekker van de kinkhoest.
De groei van de daarbij veelal optredende infecties werd door toevoeging der penicilline-oplossing nl. onderdrukt. Daardoor werd een betere bestudering der ziekteverwekkende micro-organismen mogelijk en konden bijv. ten aanzien van de immunisatie tegen kinkhoest belangrijke vorderingen worden gemaakt. Het voortdurend werken met de Penicillium notatum stam bracht bovendien mee, dat deze stam steeds werd overgeënt en in actieve vorm behouden bleef.
In de jaren 1932-1934 zetten Clutterbuck, Lovell en Raistrick de pogingen voort om de actieve stof uit het cultuur-milieu af te zonderen. Voor de cultuur werd een synthetische voedingsbodem gebruikt en de onderzoekers stelden vast, dat het penicilline uit de voedingsbodem met behulp van organische oplosmiddelen kon worden geëxtraheerd, tevens echter dat de stof zeer onbestendig was. Hierdoor, en door het gebrek aan klinische medewerking, werd het onderzoek afgebroken. De ontdekking van Prontosil (1935) en daarna de snelle ontwikkeling van de sulfonamide-therapie (Sulfapyridine, sulfathiazol) waardoor de ideale, weinig vergiftige en sterk antibacteriële middelen schenen te zijn gevonden, deden de belangstelling voor antibiotica nog meer verminderen. Tot 1939 had geen enkel extract of geen enkele stof uit micro-organismen in therapeutisch opzicht een blijvende plaats veroverd. Ook het pyocyanase was toen vrijwel uit de kliniek verdwenen, voornamelijk omdat de praeparaten te dikwijls hun activiteit bleken te hebben verloren, hetgeen door onvoldoende controle bij bereiding en verdere behandeling niet tijdig was ontdekt.
De publicaties van Dubos en medewerkers (1939) over een tegen pneumo- en streptococcen buitengewoon actieve stof uit bepaalde bodembacteriën (B. brevis) wekten echter opnieuw de belangstelling voor de antibiotica, mede doordat deze onderzoekingen in kwaliteit alle tot nu toe op dit terrein verrichte overtroffen. Oorspronkelijk meende men met één stof, welke tyrothricine werd genoemd, te doen te hebben, doch voortgezet onderzoek toonde aan, dat in feite twee componenten aanwezig waren, nu aangeduid met gramicidine en tyrocidine. Beide zijn eiwitachtige verbindingen met een hoog moleculair gewicht, eigenlijk kristallijnen polypeptides, waarvan merkwaardigerwijs bleek dat zij in tegenstelling tot de normale eiwitten, welke uitsluitend uit 1-aminozuren zijn opgebouwd, zgn. „onnatuurlijke” d-aminozuren als bouwstenen bevatten. Deze komen in de natuur overigens slechts sporadisch voor, nl. in de alkaloïden van het moederkoorn, in de kapselsubstantie van de miltvuur-bacteriën en B. mesentericus en blijkens Kögl’s onderzoekingen in de eiwitten van tumoren. Na inspuiting in een ader zijn deze verbindingen zeer giftig; inspuitingen in de buikholte geven minder bezwaren, waardoor toepassing, vnl. in de veterinaire praktijk, mogelijk is. Toevoeging van formaldehyde aan gramicidine zou — volgens enkele publicaties — de toxiciteit in belangrijke mate verminderen. Voor zover het de therapie bij den mens betreft, zijn gramicidine en tyrocidine echter geheel door het minder giftige penicilline overvleugeld.
Het onderzoek naar penicilline was in 1938 opnieuw begonnen, nu in Oxford, door een team van bacteriologen, chemici, medici e.a. (Florey, Chain, Abraham, Gardner, Heatley), ten gevolge waarvan de principiële bezwaren van te eenzijdige opzet, waardoor mede vroegere pogingen hadden gefaald, van het begin af afwezig waren. De werkwijze was zeer systematisch, er werd begonnen met het invoeren van een eenheid, waarin de antibiotische activiteit werd uitgedrukt: 1 Oxford eenheid (O.E.) = die hoeveelheid penicilline in 50 cm3 cultuurvloeistof, welke de groei van een bepaalde Staph. aureus-stam juist geheel onderdrukt. Controle geschiedde naar de maatstaf van een standaard. Bovendien werden kwantitatieve test-methodes uitgewerkt, welke het mogelijk maken de gang van het concentreringsproces te volgen. De meest bekende en in gebruik zijnde methode is wel de ring- of cilinder-test volgens Heatley, waarbij de te onderzoeken oplossing wordt gebracht in porseleinen of glazen cilindertjes, welke aan beide zijden open zijn en zich bevinden op een agar-plaat, welke met een Staphylococcus-cultuur is beënt. De oplossing diffundeert in de agar en veroorzaakt, afhankelijk van de sterkte, een kleinere of grotere zone om het cilindertje, waar geen groei van de Staphylococcus optreedt.
Door vergelijking met het effect van een standaard-oplossing kan men nu de werking kwantitatief bepalen. Variaties zijn, dat men de oplossing brengt in in de agar-plaat uitgeponste cilindervormige ruimten of wel filtreerpapierschijfjes drenkt in de oplossing en deze dan op de agar-plaat brengt. De eerste praeparaten bezaten ongeveer een activiteit van 40-50 O.E./mg, dat wil dus zeggen dat zij in vitro actief waren in een verdunning 1 : 2.500.000. Deze voordien ongekend sterke werking ener anti-bacteriële stof leidde tot de onderstelling, dat men het penicilline al vrijwel zuiver in handen had, terwijl achteraf bleek dat in dit stadium nog slechts een concentraat van 2-3 pct was verkregen! De hiermede verrichte klinische proeven gaven echter reeds een veelbelovend effect. Eind 1941 kwamen de onderzoekers via het Bazout tot 240 O.E./ mg en in de loop van 1942 met verfijnde methodes tot 450-500 O.E./mg.
Heilbron en medewerkers bereikten met chromatografische adsorptie aan voorbehandeld silica-gel een verdere zuivering tot 750 O.E./mg. Verdere mededelingen over het verloop van het onderzoek bleven daarna volledig uit: penicilline was een factor in de oorlogvoering geworden!
Penicilline in de oorlog.
De oorlogsverwondingen vroegen nu om grootscheepse penicillineproductie. Voor de overgang van het laboratorium naar de fabriek boden de V.S. door ligging en technische outillage de beste mogelijkheden en daar verrezen dan ook de speciale „penicillinplants”. Tal van soms onoverkomelijk lijkende moeilijkheden moesten bij deze bewerking in het groot worden overwonnen. Om enkele te noemen: er moest in voordien ongekende omvang aseptisch worden gewerkt, daar bepaalde secundaire infecties een penicilline splitsend ferment (penicillinase) bleken mede te brengen, waardoor de gehele opbrengst verloren kon gaan. Voorts moest dikwijls op korte termijn de productie van voor de voedingsbodem benodigde bestanddelen worden vergroot. Somtijds bleken de problemen pas oplosbaar door zeer bepaalde vondsten, als bijv. de toevoeging van een afvalproduct der maïszetmeelfabricage (corn steeping liquor), waardoor een tienvoudige opbrengst per zelfde volume voedingsbodem werd verkregen.
De gewenste productiestijging kwam tot stand: opbrengst was in 1943: 22 milliard O.E., in 1944: 1600 milliard O.E. en eind 1945 van 15 Amerikaanse fabrieken: 700 milliard O.E. per maand, waardoor maandelijks een behandeling van ongeveer 1,5 millioen zieken mogelijk werd.
De gebruikte cultuurmethodes kunnen als volgt worden onderscheiden:
1. Oppervlakte-cultuur in platte flessen van glas of porselein, welke dan in zeer grote aantallen moeten worden gebruikt, echter een gemakkelijke sterilisatie van de voedingsbodem mogelijk maken. Duur van de groei, na beënten met P. notatum tot het opwerken, 1-2 weken.
2. Diepte-cultuur in grote tanks („submerged culture”), waarin door aëratie een veel groter oppervlak wordt benut. Hiervoor worden speciale stammen van de P. notatum geselecteerd. Duur van de groei kan bij deze werkwijze tot twee dagen worden beperkt. Een bezwaar vormen de veel grotere moeilijkheden bij de sterilisatie.
3. Cultuur op half-vaste voedingsbodem, bijv. zemelen, welke direct voor extractie geschikt is. Ook hier een veel kortere groeitijd dan bij de eerste methode, nl. 2-4 dagen. Bezwaar is als bij de onder 2 genoemde werkwijze, de moeilijke sterilisatie, terwijl bovendien soms te grote plaatselijke warmte-ontwikkeling kan optreden, waardoor het gevormde penicilline ontleedt.
Bij de technische penicilline-bereiding volgt men vrijwel uitsluitend de tweede of derde methode of varianten. De extractie van het gevormde penicilline geschiedt met organische oplosmiddelen, waaraan het vervolgens weer wordt onttrokken met phosphaatbuffer of zeer verdunde loog. Door deze bewerkingen enige malen te herhalen, waarbij dus tussentijds weer moet worden aangezuurd, komt men veelal reeds tot een klinisch bruikbaar product. Uit de uiteindelijk verkregen waterige oplossing wordt het water volgens de zgn. „lyophiele” droogmethode verwijderd, d.w.z. de oplossing wordt bevroren en het ijs bij zeer lage druk weggesublimeerd. Het aldus verkregen lichtgeel tot bruin gekleurde poeder bevat 25-50 pct penicilline (meestal in de vorm van het natrium-of calciumzout) en wordt in hoeveelheden van 100 000-200 000 O.E. in steriele ampullen verpakt, welke voor de klinische toepassingen dienen.
Het penicilline is inmiddels ook op grote schaal in geheel zuivere vorm verkregen, waardoor andere doseringsmogelijkheden zijn ontstaan.
Structuur.
De handelspraeparaten zijn penicilline-concentraten; de chemische onderzoekers hebben zich hiermede niet tevreden gesteld, doch getracht het penicilline in zuivere toestand te isoleren, ten einde de structuur te leren kennen. Men onderscheidt reeds een viertal penicillines, welke verschillen in structuur van een zijketen en in activiteit. In Engeland worden deze aangeduid met penicilline I, II, III en K, in Amerika met penicilline F, G, X resp. K. Hiervan schijnt penicilline II (G) het belangrijkste bestanddeel der meeste handelspraeparaten te zijn. De stof bezit 1650 O.E./mg.
Het penicilline III (X) of allopenicilline is zwakker werkzaam (900 O.E./mg). Van het penicilline II (G) hebben Mc Phillamy en Wintersteiner het eerst het natriumzout in zuiver kristallijnen vorm verkregen (1943). Dit zout is inmiddels als internationale penicilline-standaard aanvaard, terwijl als penicilline-eenheid werd aangenomen 0,6 van deze standaard.
In een publicatie van het Amerikaanse Committee on Medical Research en de Engelse Medical Research Council zijn de tot einde 1944 verkregen resultaten van het structuuronderzoek samengevat.
Andere antibiotica.
Het onderzoek over penicilline is gevolgd door een, zoals Florey het heeft genoemd, antibiotica-„gold rush”, waarbij is gebleken dat nog tal van andere door schimmels en bacteriën geproduceerde verbindingen interessante antibiotische eigenschappen bezitten. In totaal werd een veertigtal in het onderzoek betrokken, waarbij dikwijls op de resultaten van onderzoekers uit het einde der vorige en het begin dezer eeuw is teruggegrepen, waarvan wij in het begin van ons overzicht er enkele noemden.
Enige om bepaalde reden in het bijzonder interessante verbindingen worden hier nog apart vermeld.
Helvolzuur (C32H44O8) werd uit de reeds door Vaudremer (1913) onderzochte Aspergillus fumigatus geïsoleerd en biedt perspectief, daar de stof relatief weinig giftig is en in vitro actief is tegen Myc. tuberculosis. Om deze reden staan ook weer de cultuurfiltraten van B. subtilis in het middelpunt der belangstelling (subtiline, subtilysine, bacitracine). Buitengewone belangstelling genieten de uit verschillende Actinomyceten verkregen verbindingen van basisch karakter, vooral het door Waksman (1944) onderzochte streptomycine uit Act. griseus. Dit is een weinig toxische base, welke in grote doses kan worden toegediend en ook actief is tegen een aantal gram-negatieve micro-organismen als bijv. B. coli, Ps. pyocyanea. Bovendien vertoont streptomycine, zowel in vitro als in vivo (z caviae), effect tegen de verwekker der tuberculose. Onderzoekingen over toepassing bij typhus zijn aan de gang. Hiermede zou het antibiotische „palet” dus wezenlijk worden uitgebreid. Blijkens mededelingen in een voordracht van Florey ligt het optimum der werking dezer basische stoffen echter bij een relatief hoge pH, terwijl autolyserend weefsel en pus meestentijds vrij zuur zijn, zodat hij tegen te groot optimisme waarschuwde. Zo is inmiddels reeds gebleken, dat ten aanzien van de bestrijding van typhus, streptomycine niet aan de oorspronkelijke verwachtingen beantwoordt.
Op grond van recente mededelingen der belangrijkste onderzoekers op dit gebied (Hinshaw, Feldman en Pfuetze) lijkt het nodig ook met betrekking tot de toepassing bij tuberculose, voorlopig nog reserve te betrachten, teneinde geen overdreven verwachtingen te wekken.
Volgens onderzoekingen van Folkers en medewerkers, Wintersteiner en Carter bezit streptomycine de empirische samenstelling C21H39O12N7. Streptomycine is opgebouwd uit een basische component streptidine, welke glucosidisch is gekoppeld aan een aminobiose, welke met streptobiosamine wordt aangeduid.
Hydrolyse van streptidine levert een diamine (streptamine), dat een diamino-tetraoxy-cyclohexaan bleek te zijn, waardoor tevens de structuur van streptidine bekend werd, terwijl streptobiosamine opgebouwd is uit N-methyl-1-glucosamine en een hexose-achtige verbinding, welke streptose werd genoemd. Streptose bleek zeer ongewoon van structuur te zijn en twee carbonylfuncties te bezitten.
Nederlands onderzoek.
Ook in Nederland heeft men zich met vele onderzoekingen beziggehouden. Gedurende Wereldoorlog II heeft een team van Nederlandse microbiologen, chemici, pharmacologen en klinici uitvoerig onderzoek verricht over een antibioticum uit Penicillium expansum, dat de naam expansine verkreeg. Interessant is hierbij dat het uitgangspunt dezer onderzoekingen een ander was dan dat der Angelsaksische,^. hetwerkvan A. van Luyck (sedert 1932) over antagonismen tussen in de bodem voorkomende, voor planten wel en niet ziekteverwekkende micro-organismen. Nadat Oosterhuis en Luyken het expansine in kristallijne vorm hadden geïsoleerd, slaagden Nauta, Oosterhuis en medewerkers erin, de structuur op te helderen. De stof bleek identiek met het reeds door Engelse onderzoekers verkregen patuline (tevens identiek met clavacine, clavatine en claviformine).
Deze verbinding schijnt zeer veel voor te komen, zij is uit een elftal micro-organismen geïsoleerd. Het relatief eenvoudig gebouwde expansine is veel toxischer dan penicilline en daardoor ongeschikt voor inwendig gebruik. Blijkens in ons land verricht klinisch onderzoek zal de stof misschien van betekenis kunnen zijn bij de bestrijding van door schimmels veroorzaakte huidaandoeningen. Uit onderzoekingen van Veldstra en Havinga over groei- en remstoffen van hogere planten bleek, dat er verband is te leggen tussen de structuur en werking van bepaalde remstoffen en die van een aantal bekende antibiotica als penicilzuur en patuline, welke alle als onverzadigde lactonen kunnen worden gekarakteriseerd.
DR H. VELDSTRA
Lit.: (Samenvattingen in tijdschriften): PI. A. Plattner, Penicilline, Experientia, I, 167 (1945); J. Buchi, Penicillin, Uebersichtreferat über die Eigenschaften, Applikationsweisen und Arzneiformung, Pharmaceutica Helv. Acta, 20, 117 (1945); 21, I (1946); H. W.
Florey, The use of micro-organisms for therapeutic purposes. British Medical Journal 1945, p. 635; A. E. Oxford, The chemistry of antibiotic substances other than penicillin, Annual Review of Biochemistry, 14, 749 (1945). (Brochures, boeken): G. Bankoff, The conquest of disease: The story of penicillin (London 1946); P. Broch, J.
Kerharo, J. Nétik, J. Joffre, Fabrication de la pénicilline (Paris 1946); F. Bustinza-Lachiondo, Les Antibiotiques antimicrobiens et la pénicilline (Neuchatel 1946); A. Fleming, Penicillin, its practical application (London 1946); W. Grüninger, Penicillin (Luzern 1946); W.
E. Herrell, Penicillin and other antibiotic agents (Philadelphia, London 1945); J. A. Kolmer, Penicillin therapy (London 1945); G. Lacken, The story of penicillin (London 1945); C. Levaditi, La pénicilline et ses applications thérapeutiques (Paris 1945); R.
Martin, F. Nitti, B. Sureau, J. Berrod, La pénicilline et ses applications cliniques (Paris 1945); J. Monnier, La pénicilline à la portée du practicien (Paris 1946); id., Pénicilline, toutes ses applications thérapeutiques (Paris 1946); B. Sokolof, Penicillin, A dramatic Story (London 1945); S.
A. Waksman, Microbial antagonisms and antibiotic substances (New York 1945); A. van Luyck, Antagonisms between various micro-organisms and different species of the genus Pythium, parasitizing upon grasses and luzerne; Med. v. h. Phytopath. Lab. „Willie Commelin Scholten”, Baarn, XIV, 43. 1938.
