Polymerasekettingreactie toegepast op cDNA dat met reversief transcriptase is overgeschreven van messenger-RNA
Om de conditie van een cel of een orgaan te beoordelen wordt vaak gekeken naar de hoeveelheden van verschillende messenger-RNAs. Die mRNAs geven namelijk aan welke genen actief zijn en in welke mate. Als een cel of een orgaan wordt blootgesteld aan een verstorende factor (toxicanten, infecties) of als de cel een tumorcel is, leidt dat tot regulatie van allerlei genen en dat is goed te zien aan de aanwezige mRNAs (het transcriptoom).
De hoeveelheid messenger-RNA kan op verschillende manieren worden gemeten, o.a. door hybridisatie met een microarray en door sequentie-analyse, maar een bijzonder populaire techniek is RT-PCR. Dit werkt vooral goed als men speciaal geïnteresseerd is de expressie van bekende merkergenen waarvoor men primers heeft ontwikkeld.
RT-PCR omvat het overschrijven van mRNA naar cDNA met behulp van het enzym reversief transcriptase (zie het betreffende lemma) gevolgd door een polymerasekettingreactie op het cDNA van het gen waarin men in geïnteresseerd is. Bij gebruikmaking van een reguliere PCR wordt het amplicon zichtbaar gemaakt op een elektroforesegel. Men spreekt dan van “differential display”: als het gen door de behandeling geïnduceerd is ziet men een bandje, anders niet. Maar de RT-PCR-opzet is vooral sterk bij gebruikmaking van kwantitatieve PCR, wat leidt tot een schatting van de hoeveelheid cDNA aan het begin en daarmee van de hoeveelheid mRNA. De schatting wordt geschaald op de score voor huishoudgenen (β-actine, elongatiefactor 1α), waarvan men aanneemt dat genexpressie niet beïnvloed wordt door de bestudeerde factor. De ratio staat bekend als de mate van regulatie (“fold regulation”).
